El virus Madariaga (MADV) conocido anteriormente como el virus de la Encefalitis Equina del Este Suramericano (EEEV-SA) pertenece a la familia Togaviridae, género Alfavirus, con un genoma ARN de un tamaño aproximado de 10 a 12 kb [1]. MADV es un arbovirus endémico en Panamá asociado con brotes de encefalitis en caballos y otros equinos desde aproximadamente 1936 cuando fue documentado por primera vez en el país [2]. Estudios epidemiológicos en Panamá y América Latina, han intentado establecer asociación entre la infección de MADV y la enfermedad en humanos durante varias décadas, con resultados sugiriendo la avirulencia de este virus y su limitada capacidad para causar enfermedad humana. Sin embargo, recientemente en el año 2010, se ha reportado la emergencia de MADV como un patógeno humano en Panamá [3].

El ciclo de transmisión aún no es completamente claro, sin embargo, se sospecha que los mosquitos del género Culex actúan como su principal vector [4], específicamente las especies C. melanoconion, C. taeniopus, C. pedroi y C. bidens [2,5]. Además, hay evidencia de que los roedores podrían desempeñar un papel como reservorios de este virus, siendo las especies Zygodontomys brevicauda, Oryzomys coesi y Transandinomys bolivaris las más relevantes [6,7]. Uno de los principales retos en los países tropicales es la circulación simultánea de diversos arbovirus, muchos de los cuales comparten síntomas similares, lo que dificulta su diagnóstico clínico [8]. La detección de MADV en humanos se ha dado principalmente durante brotes de encefalitis en equinos y en estudios de vigilancia durante epidemias de otros arbovirus, como se evidenció en Haití y Brasil [9,10,11]. Además, investigaciones de seroprevalencia en Perú [12] y Panamá [13] han identificado anticuerpos contra MADV en personas asintomáticas sugiriendo que podría estar pasando desapercibido o confundido con otras enfermedades en los sistemas de salud [14].

Los síntomas más comunes observados en los recientes casos documentados de humanos con MADV son fiebre, vómitos y convulsiones [15]. No todos los casos desarrollan encefalitis; algunos pueden manifestarse como un síndrome febril indiferenciado [9,11]. Sin embargo, cuando se presenta la encefalitis, generalmente culmina en enfermedad neurológica grave con secuelas permanentes [3]. El diagnóstico de MADV durante el desarrollo de este estudio, en muestras agudas (0-5 días) se basaba en reacción de cadena de polimerasa (PCR) en tiempo final genérica y anidada, seguida de secuenciación por método de Sanger [10, 11]. Recientemente se ha implementado una técnica de tiempo real que acorta el tiempo de respuesta [16]. Para muestras convalecientes (6 días en adelante) se sigue utilizando el ensayo inmunoabsorbente (ELISA) casero, y para diferenciar anticuerpos específicos neutralizantes, se aplica la técnica de Neutralización en placa (PRNT). Estas técnicas requieren de personal altamente capacitado, tanto en biología molecular como en virología tradicional, así como infraestructura especializada y recursos financieros. Estos factores, en conjunto, dificultan su diagnóstico.

La razón de la aparición de MADV y su afectación en humanos desde el 2010 no es clara. Sin embargo, desde entonces se han observado casos esporádicos en Panamá y en otros países de América Central, Sudamérica y, más recientemente, en el Caribe [3, 17, 9]. Luego de una revisión bibliográfica en busca de metodologías moleculares no encontramos RT-qPCR específicas para MADV o que permitan cuantificar la carga viral. Las RT-PCR publicadas en el momento del estudio solo utilizaban la variante del norte en su diseño [18-21]. lo cual podría disminuir la sensibilidad de la detección de MADV ya que existen suficientes diferencias genéticas bien documentadas entre ambos virus que dieron a lugar ser clasificadas como dos especies virales distintas [5].

Por otro lado, existe evidencia científica que relaciona una alta carga viral con un desarrollo más agresivo de la enfermedad, complicaciones graves y hospitalizaciones prolongadas [22-25]. Dado que Panamá es uno de los principales países con reporte de casos y afectados por este virus, este trabajo tiene como objetivo desarrollar una herramienta cuantitativa específica para detectar y medir las partículas virales de MADV. Esta técnica contribuirá a la investigación sobre la transmisión, la virulencia, patogénesis y respuesta inmune del virus, áreas poco estudiadas, y permitirá comprender mejor su tropismo celular, su relación con enfermedades graves y la respuesta inmune del hospedador.

Este es un estudio de tipo experimental, in vitro que fue registrado en la plataforma RESEGIS del Ministerio de Salud de Panamá bajo el número 3451 y fue exento de revisión de protocolo por el Comité de Bioética del Instituto Conmemorativo Gorgas Estudios de la Salud (ICGES) Nº169/CBI/ICGES/19 ya que no se utilizaron muestras o datos humanos. Las muestras de este estudio fueron aislados virales de Madariaga, Chikungunya, Encefalitis Equina Venezolana y Mayaro conservados en el repositorio de cepas virales del Departamento de Investigación de Virología y Biotecnología (DIVB) del ICGES, preservados en congeladores a -80°C. Todos los experimentos en donde se utilizó virus infeccioso fueron realizados en las instalaciones del laboratorio de bioseguridad de riesgo biológico nivel 3 (BSL-3) del ICGES.

Diseño de oligonucleótidos específicos

Se descargaron 32 secuencias completas del genoma de MADV desde las plataformas GenBank y la base de recursos de análisis de virus patógenos (ViPR). Estas fueron agrupadas por similitud, dando un subgrupo de 23 secuencias que fueron utilizadas para este trabajo (ver Tabla Suplementaria 1). Estas secuencias fueron exportadas al programa Sequencher® (versión 5.4.6), donde se alinearon para generar una secuencia consenso. A partir de esta secuencia consenso, utilizando el programa en línea PRIMER 3, se diseñaron juegos de cebadores y sondas que reconocen las regiones conservadas del genoma de MADV. Los cebadores y sondas fueron analizados in silico con el software Oligo Evaluator (Sigma Aldrich) para evaluar su composición y detectar posibles problemas como la formación de dímeros o estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias. La especificidad de los cebadores y sondas fue verificada mediante alineamientos nucleotídicos utilizando la herramienta BLAST. Finalmente, estos cebadores y sondas fueron sintetizados por la compañía LGC, Biosearch Technologies, en Estados Unidos.

Estandarización de la PCR en tiempo real para MADV

Producción de controles

Los aislados panameños utilizados fueron MADV1962 (GenBank KJ469565), MADV1984 (GenBank GU001936) y MADV2017 (GenBank OR644805), de los cuales se realizó una producción a gran escala.

Para esto se utilizaron células VERO (células de riñón de mono verde africano, ATCC-CCL-81) que fueron infectadas con cada aislado de MADV en el laboratorio de bioseguridad nivel 3 (BSL3) del ICGES. La infección se realizó con una hora de absorción a 37°C y 5% de CO2, utilizando Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 2% de Suero Fetal Bovino (SFB), 0.5% de Anfotericina y 1% de Penicilina/Estreptomicina. Las células se monitorearon cada 24 horas bajo un microscopio invertido (Nikon Eclipse TS100, objetivo 10x 0.25 Ph1ADL) hasta que se observó un efecto citopático (CPE). Cuando aproximadamente el 75% de las células mostraron CPE, se procedió a cosechar la producción de cada virus. Posteriormente, se extrajo el ARN viral de cada aislado utilizando el kit QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen, catálogo 52906), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Determinación de la concentración óptima de cebadores y sonda

Utilizando el kit SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, catálogo 18080051) se sintentizó ADN complementario de primera cadena a partir del ARN de MADV. Se procedió a probar distintas concentraciones de los cebadores (250, 500 y 1000 nM) con el kit de SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, catálogo 4309155) utilizando el ADNc. De igual manera, para la sonda se probaron las concentraciones de 100, 150, 200, 300 y 400 mM con el kit SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR (Invitrogen, catálogo 11732088) directamente a partir del ARN viral. Estas pruebas fueron llevadas a cabo con los ARNs de los aislados controles de MADV, en un volumen final de reacción de 25 uL en el equipo Applied Biosystems 7500Fast (Thermo Fisher Scientific).

Prueba de especificidad

Una vez encontrada la mejor concentración tanto de sondas como cebadores, se realizó un ensayo para comprobar su especificidad, utilizando ARN viral de los virus MADV, Encefalitis Equina Venezolana (VEEV) (ICGES_A001877), Chikungunya (CHIKV) (ICGES_256137) y Mayaro (MAYV) (AVR0565), todos del género Alfavirus, en el equipo Quant Studio 5 (Applied Biosystems).

Construcción de plásmido MADV para cuantificación

Para la construcción del plásmido MADV se utilizó el vector comercial pGEM TEasy-Vector (Promega, catálogo A1360) en el cual se insertó el fragmento amplificado de la PCR obtenido con el aislado MADV1984 (Figura suplementaria 1). El plásmido final fue verificado por medio de digestión enzimática, utilizando la enzima ECORI (NEB R0101s) y por medio de secuenciación de Sanger utilizando los cebadores M13.

Límite de detección de la técnica de RT-qPCR

El ADN del plásmido construido se cuantificó en el NanoDrop 200c (Thermo Scientific) y se determinó el número de copias por mL. Para conocer el límite de detección (LOD por sus siglas en inglés límite de detección) de la técnica RT-qPCR diseñada, se procedió a hacer diluciones seriadas del plásmido con un fragmento de MADV desde la concentración 10⁹ hasta 10 copias/mL. Cada dilución se hizo en duplicado y se añadió un pocillo de control negativo y otro positivo en el termociclador de tiempo real QuantStudio5 (Applied Biosystems™) con las condiciones previamente estandarizadas.

Para detectar especificamente a MADV, se diseñó un set de cebadores y sonda que detectan la región 3´UTR, amplificando un fragmento de 111 nucleótidos (nt) (Ver Figura 1). Para estandarizar la metodología se utilizó como matriz el ARN viral del aislado de MADV del 2010. Los resultados se visualizaron por las curvas de fusión, curva de amplificación y los valores de corte (Cts.). Se consideró la mejor concentración para cebadores y sonda, aquella que permitió obtener una buena señal de fluorescencia asociada a una buena sensibilidad y a su vez permite optimizar el uso de reactivos. Se escogió la concentración de 500 nM para los cebadores, tanto delantero como reverso, y la concentración de 200 nM para la sonda (Tabla 1).

Figura 1.

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Tabla 1.

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Para el análisis de la especificidad, se obtuvo amplificación para el aislado de MADV, con los parámetros de los cebadores y sonda seleccionados durante la implementación de la técnica, pero no para los virus VEEV, CHIKV o MAYV que son virus del mismo género Alfavirus (Ver Tabla 2). Como no se contaba con el virus de la Encefalitis Equina del Este (EEEV-NA) que es el Alfavirus con genoma con mayor similitud a MADV, y no fue posible importarlo debido a regulaciones de bioseguridad y biocustodia por su clasificación como agente selecto en Estados Unidos que es donde mayormente circula; se realizaron pruebas de amplificación in silico con el programa Genius Prime utilizando una secuencia de referencia de EEEV-NA (NC_003899) con los oligonucleóticos y sondas diseñados para MADV. En esta simulación in silico de especificidad, no hubo amplificación.

Tabla 2.

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Para determinar el límite de detección (LOD) de la prueba, se realizó una curva de dilución del plásmido que contiene el fragmento de MADV, y se logró cuantificar hasta 100 copias/mL(ver Figura 2), con un corte de positividad de Ct de 38 (ver Tabla 3).

Figura 2.

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Tabla 3.

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En este estudio, se desarrolló y estandarizó una RT-qPCR cuantitativa en tiempo real para la detección de MADV, un virus emergente en Panamá y otras regiones de las Américas. Esta técnica reconoce la región 3'UTR del genoma viral, que contiene elementos cruciales para la replicación viral y sitios de unión para los microARN celulares, los cuales son clave en la determinación del tropismo celular, el rango de huéspedes y la patogénesis del virus [26].

A pesar de que la región escogida es altamente conservada, no tuvimos reacción cruzada con virus del mismo género como VEEV, CHIKV o MAYV ya que poseen diferencias suficientes entre nucleótidos para no amplificar la región seleccionada durante el diseño de la prueba. Una de nuestras limitaciones fue que no pudimos probar esta técnica in vitro con el EEEV-NA, sin embargo, la prueba in silico realizada con el programa Genius Prime no obtuvo amplificación, mostrando una gran especificidad de la prueba hacia MADV.

La RT-qPCR diseñada logró detectar hasta 100 copias de ADN plasmídico conteniendo un fragmento de MADV/mL, lo que representa una LOD 10 veces mayor a la PCR anidada en tiempo final que fue utilizada durante varios años como metodología diagnóstica y posee un LOD de 1000 copias en su PCR inicial [27].

Teniendo en cuenta que el objetivo principal de este estudio era obtener una metodología rápida y cuantitativa para estudios de investigación en virología e inmunología de MADV, es importante señalar que la estandarización fue realizada con ARN viral procedente de aislados producidos en cultivos de células de primates no humanos infectadas, no se probaron ni con mosquitos ni con muestras veterinarias ni con muestras clínicas y por esta razón podría haber variabilidad en la sensibilidad de esta técnicas con diferentes tipo de muestras provenientes de diferentes especies.

A pesar de que, al inicio de este estudio, no existían técnicas moleculares específicas para la detección de MADV, en 2023 se optimizó una RT-qPCR multiplex validada tanto para mosquitos como para muestras humanas, la cual permite diferenciar entre el virus de Encefalitis Equina Venezolana (VEEV) y MADV [16]. Esta nueva técnica ha reducido el tiempo de respuesta en el diagnóstico diferencial de las encefalitis. Sin embargo, la RT-qPCR de MADV desarrollada en este estudio ofrece, además de la identificación del virus, la capacidad de cuantificar cargas virales por medio del plásmido construido.

La técnica de RT-qPCR en tiempo real desarrollada permite la cuantificación específica del MADV con un límite de detección de 100 copias de ARN viral por mL. Este trabajo abre la puerta a futuros estudios en biomedicina, como la caracterización de la respuesta inmune a nivel celular, la búsqueda de antivirales o posibles blancos terapéuticos en los cuales será crucial poder cuantificar la replicación viral.

Agradecimientos

Agradecemos a la Mgter. Yamitzel Zaldivar y al personal del Departamento de Investigación y Vigilancia de Riesgo Biológico 3 del ICGES por entrenamientos y soporte en el uso del laboratorio BSL3, a Briggite Henríquez y Angélica Castro por asistencia técnica con el secuenciador Sanger, a los doctores Davis Beltrán y Celestino Aguilar por asistencia en la elaboración de imágenes y análisis bioinformáticos.